核酸原位雜交可根據(jù)其檢測物而分為細胞內原位雜交和組織切片內原位雜交;根據(jù)其所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA雜交。但不論哪種雜交都必須經(jīng)過組織細胞的固定,預雜交,雜交,沖等一系列洗步驟及自顯影或酶法顯色以顯示雜交結果。
我們在這兒介紹的是整胚原位雜交,不同于一般的在載片上對細胞和組織切片進行探針雜交及檢測的原位雜交,
和其它實驗方法一樣,必須同時設對照試驗以證明其實驗結果特異性。對照試驗的設置須根據(jù)核酸探針和靶核苷酸的種類和現(xiàn)有的可能條件去選定。ISHH的優(yōu)點是它的高度特異性,它可測定組織、培養(yǎng)的單個細胞或細胞提取物中的核苷酸含量。應用高敏感度的性標記cRNA探針在理想的ISHH的實驗條件下檢測mRNA,其敏感度可達到20個mRNA拷貝/每個細胞。由于雙鏈DNA的穩(wěn)定性,在用ISHH定位DNA時很少發(fā)生丟失,降解,其敏感性高到能夠顯示在染色體鋪片上,有時甚至在組織切片上的單個基因拷貝。正因為如此,對ISHH結果的解釋應持慎重態(tài)度,特別是前人未報告過的新發(fā)現(xiàn)。在原位雜交過程中,需要使用標記的核酸探針,通常是在性核素或非性物質中標記的。這些探針可以通過不同的方式制備,例如從已知序列的DNA或RNA制備,或者通過使用生物信息學方法設計和合成新的探針。
在進行原位雜交時,細胞或組織需要固定在適當?shù)闹С治锷?,例如載玻片。然后,GISH,探針與細胞或組織中的DNA或RNA進行雜交,通常是在加熱條件下進行的。接下來,通過洗滌和顯影步驟去除未結合的探針和信號增強劑,后用顯微鏡觀察雜交信號的位置。
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